本发明公开了生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸。底物浓度可高达250g/L，反应时间短，对底物的转化率高达98％以上，所获得的产品纯度在99％以上；反应体系中NAD+循环再生，极大降低了辅酶NAD+的使用量，酶催化反应的成本降低，利于工业放大；将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，在工业化生产中，减少发酵的次数，简化了工艺，节约时间成本和原料成本。