本发明属于生物医药、细胞生物学、肿瘤临床医学等技术领域，具体涉及一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体NK细胞及制备方法和应用。本发明靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体NK细胞通过下述方法制备得到：(1)选购Anit‑CD16+，Anti‑KIF20A单克隆抗体；(2)取人源CD16单克隆抗体，溶于交联剂Traut' s试剂中，得到人源CD16单链抗体；(3)取人源KIF20A单克隆抗体，溶于交联剂Sulfo‑SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；(4)将人源CD16单链抗体和人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose‑G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；(5)将单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，得到双抗体复合物；(6)采用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定双抗体复合物分子量，凝胶柱纯化并超滤浓缩，得双特异性抗体复合物。