本发明涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明通过Tlrgt2基因上下游同源臂序列、潮霉素抗性基因hph序列构建Tlrgt2敲除载体，采用基因敲除的方法制备得到ΔTlrgt2木霉工程菌株，敲除Tlrgt2基因，可以有效地提高菌株的peptaibols抗菌肽生产能力。本发明构建的ΔTlrgt2木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高木霉peptaibols抗菌肽的产量，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍，因此本发明有助于木霉peptaibols抗菌肽在医药和农业上的应用。