本发明提供了一种高纯度米尔贝霉素的制备方法，包括将米尔贝霉素发酵液的滤渣经低沸点的醇萃取后，经热水减压浓缩，降温过滤去固形物；滤液加入强极性有机溶媒反萃，反萃后的料液经盐洗、碱洗、水洗后浓缩至干；加入强极性溶媒溶解后维持在一定的温度搅拌下加入大量的低极性溶媒，搅拌下降温、析晶、过滤得到高纯度的米尔贝霉素。本发明的方法采用了相转移以及溶解度和极性差异的原理，代替了传统的大孔树脂吸附分离技术和硅胶层析技术，该技术简单稳定可控，能够缩短生产周期，节约大量的有机溶媒，减少大量的固体废弃物，从而节约了能源降低了生产成本。