本发明公开了一种分离利奈唑胺和其手性异构体的高效液相色谱方法，色谱参数为：色谱柱：Agilent ZORBAX Extend‑C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：体积比为82 : 10 : 8的水‑乙腈‑吡啶溶液，其中含有20mM(3S, 4R)‑1‑Cbz‑4‑甲基吡咯烷‑3‑甲酸；流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～7min，0％B；7～30min，0％～90％B；30～40min，90％～0％B；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。本发明通过添加手性试剂(3S, 4R)‑1‑Cbz‑4‑甲基吡咯烷‑3‑甲酸使用常规的C18色谱柱即可有效分离利奈唑胺和其手性异构体，分离效果优异，分离检测成本低廉。