本发明公开了一种分离(R)‑甲氯噻嗪和(S)‑甲氯噻嗪的HPLC方法，色谱参数为：色谱柱：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：体积比为70 : 25 : 5的水‑乙腈‑四氢呋喃溶液，其中含有20mM(1R, 2R)‑2‑氨基环戊烷甲酸乙酯；流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～5min，0％B；5～30min，0％～70％B；30～40min，70％～0％B；流速：1.2mL/min；柱温：35℃。本发明通过添加手性试剂使用常规的C18色谱柱即可有效分离利尿药甲氯噻嗪药物对映体，分离效果优异，检测成本低廉。