本发明公开了三种用于DNA编码化合物库构建中的T4 DNA连接酶缓冲液，1)无DTT的10X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是10～1000mM Tris‑HCl，10～500mM MgCl2，1～50mM ATP，pH 6.0～10.0；2)无Tris的2X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mM MgCl2，0.1～5.0mM ATP，1～20％的1, 3‑丙二醇，0.1～5.0mM DTT，pH 6.0～10.0；3)无Tris，无DTT的2X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mM MgCl2，0.1～5.0mM ATP，1～20％的1, 3‑丙二醇，pH 6.0～10.0。本发明还公开上述三种T4 DNA连接酶缓冲液的应用。本发明提供的缓冲液及其应用，克服了现有缓冲液酶链反应后残留成分对下一步化学反应带来不利影响的缺陷，缩短了DNA编码化合物库的合成周期。