本发明公开了一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，属于海藻寡糖提取技术领域。该方法包括以下步骤：(1)Cellulophaga sp.QY201菌种发酵制备粗酶液；(2)丙酮沉淀粗分离；(3)离子交换层析：(4)凝胶过滤层析制备卡拉胶酶；(5)用水将Iota卡拉胶溶解；(6)Iota卡拉胶的酶解；(7)酶解液灭活、离心、冻干，制备出新Iota卡拉胶寡糖。本发明能够快速、大量的制备新Iota卡拉胶寡糖，且制备的新Iota卡拉胶寡糖产物分布均一，主要含有新Iota卡拉胶2糖、新Iota卡拉胶4糖、新Iota卡拉胶6糖和新Iota卡拉胶8糖，纯度高，生物活性强；采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、条件温和、质量稳定，能够规模化制备新Iota卡拉胶寡糖，可为医药、农业、食品等领域研究与开发提供高纯度卡拉胶寡糖产品。