本发明涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，属于分子生物学技术领域。当前，在真核细胞中表达外源基因存在着操作繁琐、周期较长、成本较高和库容量较低等弊端，严重限制在真核细胞中的进化效率。本发明通过基因重组双点交换原理，利用重叠延伸PCR技术，仅需要200ng突变的线性DNA片段，通过电击转化就可以获得106个/ug的突变库容量，同时周期由原来的72h缩减到4h内完成，中间过程也省去了转入细菌复制和限制性内切酶消化的繁琐操作步骤。本发明的方法步骤简便、经济、高效，为生物酶在真核细胞中的进化提供了高效的操作方法，加快了真核细胞中表达的蛋白酶在医药领域的应用。