本发明涉及一种细胞冻存液及其应用，属于细胞生物技术领域。本发明的细胞冻存液包括基本培养基、丙三醇、脯氨酸、四氢甲基嘧啶羧酸和右旋糖酐，所述基本培养基、丙三醇和四氢甲基嘧啶羧酸的体积比为基本培养基：丙三醇：四氢甲基嘧啶羧酸＝100：20‑50：15‑30；所述基本培养基的体积与脯氨酸和右旋糖酐的质量的比为基本培养基：脯氨酸：右旋糖酐＝100mL：5‑15g：5‑20g。本发明的细胞冻存液不含血清和DMSO，避免了病原菌的污染和DMSO的细胞毒性。本发明的细胞冻存液由纯化学物质组成，成分稳定，批次间稳定性好；并且，采用本发明细胞冻存液冻存的细胞复苏后细胞活力显著增强。