本发明涉及一种大规模纯化质粒DNA的方法，属于DNA疫苗、核酸疫苗、基因治疗等生物工程技术领域。本发明通过对碱裂解液加入硅藻土助滤澄清来获得简便、快速的分离效果，再经过澄清裂解液的浓缩超滤、分子筛层析、亲和层析、阴离子交换层析、终产品的置换浓缩、除菌过滤等纯化步骤，可生产出符合药用标准的质粒DNA产品。本发明首次使用硅藻土助滤并应用于质粒DNA产品的纯化领域中，操作方法简便易放大；本发明提供的质粒DNA纯化方法操作性强、重复性好、纯化的质粒DNA总回收率高并符合药用标准，可满足工业化大生产要求。