本发明涉及一种用于DNA编码化合物库构建中的碱性缓冲液及其应用，该碱性缓冲液是浓度为250mM的硼酸缓冲液，所述硼酸缓冲液的电导率为5177ppm±10％，密度为1.0246g/mL±3％，pH为9.4±0.1。该缓冲液具有底物适用性广、通用性高的特点，其应用于DNA‑CO2H与小分子有机胺的酰胺合成反应，和应用于DNA‑NH2与小分子有机醛生成亚胺，亚胺再经硼氢化钠还原的还原氨化反应，具有转化率高的优势。通过本发明得到的可用于DNA编码化合物库合成的几种碱性缓冲液下的反应条件，反应条件温和，操作简单，底物适用性广，具有较强的适用性，适合大规模应用于DNA编码化合物库的合成中。