本发明涉及一种以鸡内金为原料，经过物料处理、低温灭菌、研磨打浆、发酵、后熟、过滤、超高静压灭菌等制备鸡内金酵素的方法，以及该方法制备出的鸡内金酵素及其应用。本发明方法制备得到的鸡内金酵素利用低温灭菌、严格控制发酵温度，利用三次植入发酵菌，有效降低了鸡内金酵素中有效成分的损失，抑制了其它杂菌的滋生，最大限度的保留了鸡内金酵素活性。同时，鸡内金酵素具有健脾燥湿、益气消积、调节人体生理机能等功效优势，用于小儿积滞，厌食，疳症等属脾虚夹有食积者，在食品工业、保健品和医药等领域具有广阔的开发应用前景。