本发明公开了一种高效液相色谱‑串联质谱检测血清雌激素的试剂盒和方法，试剂盒包括洗脱液、稀释液、萃取剂、质控品和色谱柱，萃取剂为乙酸乙酯/正己烷；检测血清中雌激素的方法，包括如下步骤：(1)样本预处理；(2)色谱分离；(3)质谱检测；(4)利用系列浓度的雌激素标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中雌激素的含量。采用本发明的检测试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅需要一步液液萃取过程，就能有效提取样本中的雌激素，时间大大缩短，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的雌激素同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性。