本发明涉及一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的引物、试剂盒及方法，属于生物医药技术领域。本发明的检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物序列为：正向引物：5′‑ACGTTGACGATAGGGGGAGA‑3′；反向引物：5′‑CTTTGGCAAAGACCCCGTTG‑3′；试剂盒还包括阳性质控品和内参管家基因GAPDH引物序列，其引物序列为：正向引物：5′‑CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA‑3′；反向引物：5′‑TGGTGAAGACGCCAGTAGATT‑3′。本发明的试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高效率高的特点，且操作简单，节约时间。