一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法，包括：将包含微生物目标序列的DNA样本片段化，然后进行末端修复；将末端修复后的DNA片段连接接头；使用单引物探针与靶序列的探针结合位点退火并延伸以进行靶序列捕获，其中探针结合位点位于靶序列的上游或下游，单引物探针包括探针序列部分和位于探针序列部分5’端的公共序列部分；使用一对通用PCR引物对捕获的靶序列进行扩增；对扩增产物进行测序分析。本发明的方法省去洗脱进行目的片段分离，简化操作步骤，减少目的片段不必要的损失，且杂交时间相对较短，适合快速检测需求；单引物探针即可进行捕获，减少前期探针设计的复杂度；扩增时采用公用引物去除不同引物富集产生的不均一性。