本发明提供一种补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法，其特征在于，以吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus)作为发酵菌种，将种子液接入装有液体发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产雷帕霉素，发酵罐培养时间为168‑216h；其中，发酵48h开始用氨水控制发酵液pH值为4.65‑5.15，发酵96h开始按每天批补葡萄糖水溶液，直至发酵结束。采用本发明的补料工艺，所需原材料成本低廉，操作简便，结果稳定，HPLC法测定发酵单位可达1000ug/ml以上，适合于规模化生产。