本发明公开一种层析和超滤分离技术制备依诺肝素钠的方法。肝素钠依次经过季铵盐盐化、苄基酯化、碱性降解、过滤除杂、氧化脱色等处理得到依诺肝素钠粗品；依诺肝素钠粗品经过离子交换层析、超滤分离、冻干得到符合要求的依诺肝素钠精品。本发明利用离子交换层析技术对依诺肝素钠的分子量及分布进行有效控制；通过超滤分离技术与层析技术有效的结合，达到浓缩和脱盐的目的，减少了有机溶剂的使用，同时缩小了冻干的体积，提高了产能，节约了成本。