本发明公开了一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，属于微生物技术领域。所述方法包括如下：将猴头菌菌株接种到液体种子培养基培养至对数期，将种子转接到发酵培养基中，添加玻璃珠打散菌体，同时添加辅酶促进转化，控制pH值、温度及碳源浓度，置于摇床上振荡发酵，发酵液经酶解使菌丝形成原生质体破壁单细胞，再经加热、脱色，过滤、超滤、反复醇沉、干燥沉淀，即可制得高纯度猴头菌多糖，该多糖纯度可达90％以上，含量约为5～6g/L。