本发明公开了一种发酵生产叶酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明的方法为先将产朊假丝酵母接种于发酵培养基中，于温度20～30℃、pH 6～8的条件下发酵培养16～22h，再在发酵培养中添加乳糖和/或乳酸，于温度5～15℃、pH 4.5～6的条件下继续发酵培养20～30h以提高发酵生产叶酸的产量；利用本发明的方法，可将发酵生产叶酸的产量由2.2μg/mL提升至4.9μg/mL。