本发明提供了一种肠道微生物分离装置及分离方法，所述分离装置包括由上至下顺次连接的进料单元、过滤单元和分装单元；所述的进料单元包括原物罐，所述原物罐底部固定有搅拌装置；所述分装单元包括菌液储存罐；所述分离装置包括与所述菌液储存罐的负压接口连接的抽真空装置；所述分离装置还包括除臭单元，所述除臭单元连接所述原物罐的臭气出口和所述抽真空装置。该分离装置中的进料单元、多级过滤、分装单元为垂直分布，通过增设真空泵，粪便原料可在重力和负压的作用下流至下一级，大大减少了过滤过程中的堵塞现象。