本发明提供了具备透明质酸酶活性的靶向融合蛋白、制备方法及应用，该融合蛋白为包含ABC三条肽链的三聚体，A肽链为透明质酸酶融合肽链，B肽链为IgG抗体重链突变体，C肽链为IgG抗体轻链或轻链突变体。A肽链结构通式为γ1‑γ3或者γ1‑γ2‑γ3，γ1为透明质酸酶类似物，包括HYALl基因、HYAL2基因或PH20/SPAM1基因表达序列；γ2为肽接头；γ3为人IgG抗体Fc区hole突变体或knob突变体，hole突变体和knob突变体形成特异性二聚体。当Fc区不保留铰链区时，采用肽接头，透明质酸酶类似物C末端残基直接融合至肽接头N末端残基，其C末端残基直接融合至hole突变体或knob突变体的N末端；当Fc区保留部分或全部铰链区时，不采用肽接头，透明质酸酶类似物的C末端残基直接融合至hole突变体或knob突变体的N末端。