本发明公开了了一种黑草中总黄酮的提取和测定方法，用D101大孔树脂装柱，乙醇洗脱提取黑草总黄酮；以芦丁作为对照品，加入亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠测定吸光度，依次确定总黄酮含量，通过高效液相色谱法测定出黑草总黄酮中木犀草素、芹菜素及香叶木素的含量，流动相为乙腈‑0.1%磷酸，安捷伦ZORBAX Eclipse XDB‑C18为色谱柱，检测波长350nm。黑草总黄酮具有抗凝、抗炎、镇静和抗过敏作用，且毒性小，本发明为黑草总黄酮的药用价值开发提供了参考数据。