一种HPLC法同时测定四种激素类药物含量的方法，包括以下步骤：S1、供试品溶液配制：取经超声提取法所得样品溶液，用稀释剂溶解制成供试品溶液；S2、对照品溶液配制：分别称取庚酸睾酮、醋酸去甲雄三烯醇酮、群勃龙庚酸酯和癸酸南诺龙四种激素类药物，用稀释剂溶解制成对照品溶液；S3、检测分析：分别取S1中供试品溶液和S2中对照品溶液进样高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定各成分保留时间，按外标法以峰面积计算供试品溶液中四种激素类药物的含量。本发明的方法能有效将四种成分分开，灵敏度高、重复性及耐用性好，结果稳定可靠，对于实现食品动物中禁用的人工合成激素类药物的定量检测具有重要意义。