本发明涉及一种分离与测定磷酸奥司他韦及其特定杂质的高效液相色谱方法，该方法采用辛烷基硅烷键合硅胶柱，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液‑甲醇‑乙腈体积比为(620 : 245 : 135)，柱温48℃~50℃，检测波长为207nm，流速为每分钟1.1~1.3ml。该方法能同时完全分离磷酸奥司他韦3个非对映异构体，2个同分异构体(杂质C、杂质D)、特定工艺杂质A、B、E，以及《中国药典》2015版中收载的磷酸奥司他韦特定杂质I、II、III，且方法简单准确、灵敏度高，对药物产品的质量控制具有非常重要的意义。