本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒。该方法包括针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团。本发明通过半巢式扩增反应引物以及酶切RNA碱基后探针与引物扩增提高检测特异性和灵敏度；利用RNaseH酶切获得带荧光标记的引物，直接对特异性产物进行熔解曲线分析，具有优异的特异性。