本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC‑HSV‑1载体和pREDI重组质粒的宿主菌；S2 BAC载体的切除及HSV‑1 UL5基因缺失的DNA疫苗的获得。本发明属于生物医药技术领域，通过本发明提供的方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV‑1的感染。