本发明提供一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的试剂盒，利用TaqMan探针多色荧光PCR技术，选择在病毒序列相对保守序列设计肠道病毒通用引物，并通过特异性探针检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型以及柯萨奇病毒A16型。本发明试剂盒检测过程无需荧光PCR后的熔解曲线分析而仅凭不同荧光标记的探针检测就能检测肠道病毒，并区分肠道病毒71型以及柯萨奇病毒A16型；同时本发明还引入了人工构建的内参照系统，用于避免检测结果的假阴性；试剂盒检测灵敏度高、结果稳定可靠、使用方便，适合于环境、疾控以及临床中肠道病毒、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的快速检测。