本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在乳腺癌应用。所述的双靶点CAR‑T治疗载体通过联合EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体，具体为CD8leader‑EpCAM scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑IRES‑CD8leader‑MSLN scFv‑CD8α‑CD3ζ。以病毒感染方式获得含有该治疗载体CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤高表达EpCAM和MSLN两种肿瘤相关抗原的乳腺癌细胞。