本发明公开了一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。该基因工程菌的基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。该基因工程菌的构建过程无需对菌株进行单核处理，从而避免了通过同源重组发生单交换、遗传稳定性差以及易发生回复突变等问题；该基因工程菌不产生杂色曲霉素，且棘白菌素B产量较野生菌株可提高44％，并且经过多次传代，发酵性状仍维持稳定。