一种基于高通量测序的中枢系统感染病原检测文库构建方法、检测方法和试剂盒，文库构建方法包括：从样本中提取DNA并将DNA片段化得到片段化的DNA序列；将片段化的DNA序列加入末端修复体系中进行末端修复反应，末端修复反应完成后，直接向反应体系中添加接头序列、连接酶、ATP以及聚乙二醇，在连接酶作用下以ATP为辅酶，催化接头序列连接到末端修复反应产物的两端，得到接头连接产物；纯化接头连接产物后，加入与接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增。该方法能够实现快速、广谱的中枢系统感染病原微生物检测，无需预知太多检测样本的临床信息，可以快速高效地进行检测，检测结果无偏向性，还可以解决低浓度脑脊液样本文库构建失败率高的问题。