本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肿瘤多细胞球的制备方法。将肿瘤细胞与含有聚乙二醇(PEG)链段的温敏性聚合物溶液在常温下均匀混合，升高温度到37℃，形成温敏水凝胶原位包埋细胞，细胞在水凝胶内部生长、增殖，从而形成多细胞球。所述温敏水凝胶生物相容性和可降解性良好。所述的肿瘤多细胞球的制备方法简单易行，通用性和重复性良好，可大批量构建各种尺寸的多细胞球，在药物筛选和肿瘤研究中具有广阔的应用价值。