本发明提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，该方法是在常规补料发酵工艺的基础上，通过多次循环进行部分放料和补充新鲜发酵培养基后继续发酵的工艺，将发酵液的OD600值控制在一定的范围内，使得在半连续发酵的循环期间，发酵液都处于吡咯喹啉醌高速合成期中，从而提高了生产效率。与传统的补料分批发酵工艺相比，本发明提高生产效率25～50％，降低主要发酵原料单耗12～20％，并且提高了生产连续性，具有广阔的应用前景。