本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种肺癌干细胞的制备方法及应用。该肺癌干细胞的制备方法为：步骤1)：配制含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.25％以下；步骤2)：用培养基A把肺癌细胞制成单细胞悬液A，再向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质, 得到混合液，将混合液在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；或将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中，得到培养基B, 用培养基B把肺癌细胞制成单细胞悬液B，再将单细胞悬液B在3D细胞培养条件下培养7天以上即可。本发明制备方法简单，高效稳定，肺癌干细胞干性高。