本发明公开了一种高纯度肝素季铵盐的制备方法及其应用，具体步骤为：将普通肝素和过量季铵盐分别溶于水相中，再混合反应，制得肝素苄索氯铵盐，过滤分离后将肝素苄索氯铵盐溶解于可与水互溶的有机相中，然后向其中加入纯化水，逐渐使肝素苄索氯铵盐在混合溶液中析出，过滤分离后干燥，得到高纯度肝素苄索氯铵盐，使用高纯度的肝素苄索氯铵盐制备依诺肝素钠，可稳定地控制依诺肝素钠生产的批间差异，同时控制杂质的产生，减少精制步骤，提高依诺肝素钠成品质量的同时，提高收率，最终成品依诺肝素钠完全符合欧洲药典和美国药典对依诺肝素钠原料药及其制剂的质量要求。