本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在卵巢癌中的应用。所述的双靶点CAR载体通过联合EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体，CAR的具体组成结构为CD8leader‑EpCAM scFv‑(G4S)5‑MSLN scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ。以病毒感染方式获得含有该治疗载体的CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤高表达EpCAM和MSLN两种肿瘤相关抗原的卵巢癌细胞。