本发明公开一种组织工程肌腱微组织的制备方法，属于生物医药技术领域，旨在构建一种生物源性材料，可在体外与干细胞构建肌腱微组织诱导其向肌腱方向分化，促进肌腱特定蛋白Tenomodulin以及一型和三型胶原的表达，为修复肌腱损伤提供高品质生物材料。该方法的步骤为：将大鼠尾腱取出，反复冻融若干次，在摇床上经过SDS溶液于室温下处理，制备成脱细胞的肌腱细胞外基质；将上述脱细胞的肌腱细胞外基质低温定型，经真空冷冻干燥，获得成型的肌腱细胞外基质；将上述成型的肌腱细胞外基质与P2代大鼠脂肪干细胞共培养若干天，制备出组织工程肌腱微组织。