本发明公开了一种用于检测基因突变的多定位双标签接头组及其制备方法和应用，该多定位双标签接头组由双标签接头A、双标签接头B和双标签接头C组成，双标签接头A、双标签接头B和双标签接头C分别由接头引物P5分别与5’端均修饰有生物素的接头引物P7‑A、接头引物P7‑B和接头引物P7‑C合成而得到。利用本发明的多定位双标签接头组，可以准确检测1×10‑5基因突变率，有效提高基因突变检测的灵敏度，结合高通量测序的通量，一次测序可以检测多个基因的多个突变位点。