本发明涉及兽医微生物学诊断技术领域，尤其是组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括盒体，所述盒体内的试剂包括：含有PCR引物对、2倍的PCR核心试剂预混物、阳性对照、阴性对照、DL2000分子量标准溶液。本发明提供了一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法，通过选用经比对特异性的序列zlqG片段作为扩增目的片段，具有直接确诊的效果。本试剂盒选择特异性的扩增zlqG片段引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，适合临床牛样本检测。