一种基于点击化学的测序接头、双条形码测序文库及其构建方法，该测序接头包括：日期片段，包括5’端的与正向引物部分或全部序列一致的序列、中间的日期条形码序列以及3’末端的点击化学反应基团；样本片段顶链，包括5’末端的点击化学反应基团、中间的样本条形码序列以及3’端的与反向引物部分或全部序列一致的序列；样本片段底链，包括5’末端的磷酸化修饰、中间的样本条形码序列；其中样本片段底链分别与日期片段和样本片段顶链部分杂交；杂交后日期片段的点击化学反应基团与样本片段顶链的点击化学反应基团位置接近且能发生点击化学反应而偶联。可以快速、高效地实现双条形码测序文库构建，通过测序推断出核酸文库构建的日期，实现准确的样本溯源。