本发明公开了一种从母育酚中分离纯化制备高纯度生育三烯酚的方法。现有的方法通常生产的是天然母育酚的混合物，包含了生育酚和生育三烯酚，少数溶剂萃取能分离生育酚和生育三烯酚，但是在商业规模方面经济上是不可行的。本发明通过一次中低压制备色谱从母育酚的混合物中分离纯化得到高纯度混合生育三烯酚的方法，其中制备色谱是通过正相色谱或者反相色谱纯化。采用本发明，能够在中低压下，实现原料一次上柱分离得到高含量的生育三烯酚，色谱层析柱内的填料能够再生，使用的溶剂可以回收套用，降低生产成本，简化生产设备，提高产品的竞争力。