本发明提供了测定酒石酸光学异构体含量的方法，该方法将待测酒石酸进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测是通过结合紫外检测器的高效液相色谱仪进行的，基于高效液相色谱检测结果，确定所述待测酒石酸中L(+)‑酒石酸和D(‑)‑酒石酸的含量，其中，所述待测酒石酸预先经过衍生化处理，所述衍生化处理后的酒石酸连接有发光基团。该方法可以很好地检测出酒石酸中L(+)‑酒石酸和D(‑)‑酒石酸的含量，且方法灵敏度高，专属性强，准确度高。