本发明提供单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。该方法包括针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光；在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列；和通过不同待测目标核酸序列形成带不同荧光标记的杂交链产物，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。本发明在等温扩增技术的基础上，只是通过引入一条特殊的修饰引物RNHP并结合RNaseH2就可实现实时多重的等温检测。