本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法，本方法基于一个用于扩增GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因耳聋相关突变位点的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～26所示。通过本发明建立的检测方法，利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因，仅需要5个PCR反应和测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，可以检测GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因的主要43个突变位点，并可以发现扩增片度中新的变异位点。所以此检测技术应用于耳聋易感基因突变检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。