本发明涉及一种双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明的双特异性抗体包括单克隆抗体单元和单链抗体单元；其中，单克隆抗体单元为2个完整的轻链‑重链对，特异性结合肿瘤细胞表面抗原；单链抗体单元包括2个单链抗体，单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，特异性结合免疫细胞表面抗原；本发明提供的双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：(1)2个单链抗体的C端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的N端连接；(2)2个单链抗体的N端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的C端连接。本发明的双特异性抗体能够同时结合免疫细胞和肿瘤细胞，介导导向性免疫反应，有效杀伤肿瘤细胞。