本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因突变的方法，一个用于检测叶酸代谢相关基因突变的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8所示，利用本引物组合建立了本发明建立的检测方法，本发明利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性，整个过程仅需要一次PCR反应和一个测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，就可以达到检测MTHFR和MTRR基因的与叶酸代谢相关的6个突变位点，并可以利用该方法发现扩增片段中新的变异位点。以此检测技术应用于叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。