本发明公开了一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：步骤1，供试品溶液的制备：取三白草样品粉末，加入80％甲醇，经回流提取后，用80％甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；步骤2，指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立供试品溶液的指纹图谱。本发明灵敏地对样品进行定性和定量分析，较好地反映共有峰的相似性，检测分离度较好，实验结果可靠，重复性和稳定性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间。