本发明涉及一种固相萃取柱在他克莫司制剂软膏分析中的应用，在供试品制备过程中采用以二醇基硅烷键合硅胶为填料的固相萃取柱进行纯化，通过混悬、活化、上样、淋洗、洗脱等步骤对他克莫司软膏样品中的他克莫司及其相关物质进行有效分离，且节省有机溶剂、用时较短、专属性好，不存在辅料干扰他克莫司杂质检测，杂质回收率也符合要求，特别适用于从他克莫司软膏的复杂基质中有效分离他克莫司及其相关物质。