一种检测N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。它可用于测定不同来源生物体系中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的酶活性。以DDAG作为特异性探针反应底物，借助N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶体外反应体系，以β‑葡萄糖醛酸苷水解反应为探针反应，通过定量检测单位时间内苷元代谢产物的生成量来测定各生物样品中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的活性。本发明可用于不同个体来源人和动物组织样本、不同种属细胞及细胞制备物、以及各种植物和微生物中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶活性的定性、定量测定，并可实现对N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶处置药物能力的评估，以及N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶抑制剂的开发筛选。