本发明公开了一种从植物甾醇发酵液萃取后的结晶母液中分离制备植物甾醛类化合物(简称BA)的方法。植物甾醇经分歧杆菌发酵得到的发酵液，再经萃取、结晶等步骤提取雄烯二酮(简称4AD)之后的结晶母液浓缩浸膏用低碳醇完全溶解后，过滤获得含有BA的滤液。用少量树脂吸附，室温下挥干，加入填充大孔吸附树脂的层析柱顶端。以不同浓度的乙醇和水的混合溶液为洗脱液进行阶段洗脱；收集含有BA的洗脱液，蒸发浓缩，之后用甲醇、乙腈、水的混合液完全溶解，置于低温下结晶，过滤洗晶后得到纯度为98.5%以上的BA。该方法工艺简单，母液可纯化回收，成本低，易于工业化，过程无污染，无废水，符合环保要求，且得到的产品符合医药行业需求。